
1500 年代後半に光学顕微鏡が発明されて以来、光学顕微鏡は基礎生物学、生物医学研究、医療診断、材料科学における私たちの知識を高めてきました。光学顕微鏡は対象物を最大 1,000 倍に拡大し、微細な細部を明らかにすることができます。光学顕微鏡技術は、ロバート フックとアントニ ファン レーウェンフックによる最初の顕微鏡をはるかに超えて進化しました。生きた細胞の構造と生化学を明らかにするために、特別な技術と光学が開発されてきました。顕微鏡もデジタル時代に入り、電荷結合素子 (CCD) とデジタル カメラを使用して画像をキャプチャします。しかし、これらの高度な顕微鏡の基本原理は、最初の生物学の授業で使用したかもしれない学生用顕微鏡の原理とよく似ています。
知恵袋ブログの今回のエディションでは、光学顕微鏡の小さな世界に入り、人間の目では検出できないものを露出させるさまざまなテクノロジーを調べます。
基本

光学顕微鏡は屈折望遠鏡と非常によく似ていますが、いくつかの小さな違いがあります。望遠鏡の仕組みを簡単に復習してみましょう。
望遠鏡は、遠くにある薄暗い物体から大量の光を集めなければなりません。したがって、できるだけ多くの光を集めて明るい焦点に合わせるには、大きな対物レンズが必要です。対物レンズが大きいため、ある程度離れた場所にある物体の像を焦点に合わせます。そのため、望遠鏡は顕微鏡よりもはるかに長いのです。望遠鏡の接眼レンズは、その画像を拡大して目に表示します。
望遠鏡とは対照的に、顕微鏡は近くにある薄くてよく照らされた標本の小さな領域から光を集める必要があります。したがって、顕微鏡には大きな対物レンズは必要ありません。代わりに、顕微鏡の対物レンズは小さくて球形なので、どちらの側の焦点距離もはるかに短くなります。顕微鏡の鏡筒内の近距離で物体の像の焦点を合わせます。画像は、目に届くと、接眼レンズまたは接眼レンズと呼ばれる 2 番目のレンズによって拡大されます。
望遠鏡と顕微鏡のもう 1 つの大きな違いは、顕微鏡には光源とコンデンサーがあることです。コンデンサーは、光源からの光を標本上の小さな明るいスポット (対物レンズが検査するのと同じ領域) に集束させるレンズ システムです。
また、固定対物レンズと交換可能な接眼レンズを備えた望遠鏡とは異なり、顕微鏡は通常、交換可能な対物レンズと固定接眼レンズを備えています。対物レンズを変更する(比較的平らな低倍率の対物レンズから、より丸い高倍率の対物レンズに切り替える)ことによって、顕微鏡はますます小さな領域を視野に入れることができます。集光は顕微鏡の対物レンズの主な仕事ではありません。望遠鏡のものです。
顕微鏡の部品については、この記事の後半で詳しく説明します。
虫眼鏡と紙を使って簡単な顕微鏡を作ることができます。
- 虫眼鏡 2 つと印刷した紙を 1 枚用意します。
- 1 つの虫眼鏡を紙の上の少し離れたところに置きます。プリントした画像が少し大きく見えます。
- 2 番目の虫眼鏡を目と 1 番目の虫眼鏡の間に置きます。
- プリントに鮮明な焦点が合うまで、2 番目のガラスを上下に動かします。最初の虫眼鏡で見たときよりも印刷物が大きく見えることがわかります。
ピンホール カメラのように機能する単純なピンホール顕微鏡を作成することもできます。詳細については、「 」を参照してください。
画質
顕微鏡を使用して標本を観察するとき、表示される画像の品質は次のように評価されます。
- 明るさ– 画像はどのくらい明るいか暗いですか?明るさは照明システムに関係しており、ランプ (加減抵抗器) への電圧を変更し、コンデンサーと絞り/ピンホールの開口部を調整することによって変更できます。明るさは対物レンズの開口数にも関係します (開口数が大きいほど、画像は明るくなります)。
- フォーカス– 画像はぼやけていますか、それとも鮮明ですか?フォーカスは焦点距離に関係しており、フォーカス ノブで制御できます。標本のスライド上のカバーガラスの厚さも、画像の焦点を合わせる能力に影響を与える可能性があります。対物レンズに対して厚すぎる可能性があります。正しいカバーガラスの厚さは対物レンズの側面に記載されています。

- 解像度– 画像内の 2 つの点が 2 つの別個の点として見えなくなるまでに、どのくらい近づけることができますか?分解能は、対物レンズの開口数 (開口数が高いほど分解能が高くなります) とレンズを通過する光の波長(波長が短いほど分解能が高くなります) に関係します。

- コントラスト– 標本の隣接する領域間の照明の違いは何ですか?コントラストは照明システムに関係しており、光の強度と絞り/ピンホールの絞りを変更することで調整できます。また、標本に化学染色を適用すると、コントラストが向上します。
次のセクションでは、さまざまな種類の顕微鏡について説明します。
顕微鏡の種類

顕微鏡で標本を観察する際の主な問題は、画像のコントラストがあまり高くないことです。これは特に生物 (細胞など) に当てはまりますが、葉の緑色などの天然色素は良好なコントラストを提供します。コントラストを改善する 1 つの方法は、標本内の特定の構造に結合する着色顔料または染料で標本を処理することです。標本のコントラストを向上させるために、さまざまなタイプの顕微鏡が開発されてきました。専門分野は主に照明システムと標本を通過する光の種類です。たとえば、暗視野顕微鏡は、日食で月が太陽からの光を遮るのと同じように、特別なコンデンサーを使用して明るい光の大部分を遮断し、斜めの光で標本を照らします。この光学セットアップは、完全に暗い背景を提供し、画像のコントラストを高めて、標本の境界にある明るい領域などの細部を鮮明にします。
さまざまな種類の光学顕微鏡技術を以下に示します。
- 明視野– これは基本的な顕微鏡構成です (これまでに見られた画像はすべて明視野顕微鏡によるものです)。このテクニックにはコントラストがほとんどありません。これまでに見た画像では、コントラストの多くは標本を染色することによって提供されています。
- ダークフィールド– 前述したように、この構成はコントラストを強化します。詳細と例については、「分子発現: 暗視野顕微鏡法」を参照してください。
- ラインベルク照明– この設定は暗視野と似ていますが、一連のフィルターを使用して標本の「光学染色」を生成します。詳細と例については、を参照してください。
以下のテクニックは、ラインベルク照明と同じ基本原理を使用し、異なる光学コンポーネントを使用することで異なる結果を実現します。基本的な考え方には、光ビームを 2 つの経路に分割して標本を照明することが含まれます。試料内の密な構造を通過する光波は、密度の低い構造を通過する光波に比べて遅くなります。すべての光波が収集されて接眼レンズに伝達されると再結合されるため、互いに干渉します。干渉パターンはコントラストを提供します。干渉パターンは、明るい背景 (密度が低い) 上に暗い領域 (密度が高い) を表示したり、一種の疑似 3 次元 (3-D) 画像を作成したりすることがあります。
- 位相コントラスト– この技術は、培養細胞などの生きた標本を観察するのに最適です。

- 微分干渉コントラスト(DIC) – DIC は、偏光フィルターとプリズムを使用して光路を分離および再結合し、標本に 3D の外観を与えます (DIC は、発明者の名前にちなんでノマルスキーとも呼ばれます)。詳細と例については、「分子式: 微分干渉顕微鏡法」を参照してください。
- ホフマン変調コントラスト– ホフマン変調コントラストは、光路の軸と軸外の両方に小さなスリットを備えたプレートを使用して、標本を通過する 2 セットの光波を生成する点を除き、DIC に似ています。再び、3D画像が形成される。詳細と例については、「分子式: ホフマン変調コントラスト顕微鏡」を参照してください。
- 偏光– 偏光顕微鏡は、標本を通過した光のみが接眼レンズに到達するように、標本の両側に 1 つずつ、互いに直角に配置された 2 つの偏光子を使用します。光は最初のフィルターを通過して標本に到達する際に 1 つの平面内で偏光されます。試料の規則的に配置されたパターン部分または結晶部分は、通過する光を回転させます。この回転された光の一部は 2 番目の偏光フィルターを通過するため、これらの規則的な間隔の領域は黒い背景に対して明るく表示されます。詳細と例については、を参照してください。
- 蛍光– このタイプの顕微鏡は、高エネルギーの短波長光 (通常は紫外線) を使用して、標本内の特定の分子内の電子を励起し、それらの電子をより高い軌道にシフトさせます。元のエネルギー レベルに戻ると、エネルギーが低く、波長が長い光 (通常は可視スペクトル内) が放出され、画像が形成されます。
次のセクションでは、蛍光顕微鏡法について詳しく説明します。
透過光で標本を観察する場合、像を形成するためには光が標本を通過する必要があります。試料が厚ければ厚いほど、通過する光は少なくなります。通過する光が少ないほど、画像は暗くなります。したがって、試験片は薄くする必要があります (0.1 ~ 0.5 mm)。多くの生きた標本は、観察する前に薄い切片に切断する必要があります。岩石や半導体の標本は厚すぎて切断して透過光で観察することができないため、表面からの反射光によって観察されます。
蛍光顕微鏡

蛍光顕微鏡は、水銀ランプまたはキセノンランプを使用して紫外線を生成します。光は顕微鏡に入り、ダイクロイックミラー(ある波長範囲を反射し、別の波長範囲を通過させるミラー)に当たります。ダイクロイックミラーは紫外光を標本まで反射します。紫外光は、標本の分子内の蛍光を励起します。対物レンズは、生成された蛍光波長光を収集します。この蛍光はダイクロイックミラーとバリアフィルター(蛍光以外の波長を除去するフィルター)を通って接眼レンズに到達し、結像されます。
標本内の蛍光分子は、自然に発生することもあれば、導入されることもあります。たとえば、 calcein/AMと呼ばれる色素で細胞を染色できます。この染料自体は蛍光性ではありません。分子の AM 部分は、カルシウムに結合する蛍光性のカルセイン分子の一部を隠します。カルセイン/AM を細胞を浸す溶液と混合すると、色素が細胞内に浸透します。生きた細胞は、AM 部分を除去し、細胞内にカルセインを捕捉し、カルセインがカルシウムと結合できるようにする酵素を持っているため、紫外線下で緑色の蛍光を発します。死んだ細胞にはこの酵素がありません。したがって、生きている細胞は緑色の蛍光を発しますが、死んだ細胞は蛍光を発しません。死んだ細胞にのみ浸透するヨウ化プロピジウムと呼ばれる別の色素を混合すると、同じ標本内の死んだ細胞を見ることができます。ヨウ化プロピジウムは核内の DNA に結合し、紫外線下で赤色の蛍光を発します。この二重染料技術は、殺虫剤などの環境化学物質で処理された場合に死滅する細胞集団の割合を決定するための毒物学研究で使用されます。


蛍光顕微鏡技術は、生きた細胞の構造を観察したり、生理学的および生化学的現象を測定したりするのに役立ちます。 DNA、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、pH、酵素などの多くの生理学的に重要な化学物質を研究するために、さまざまな蛍光指示薬が利用できます。さらに、さまざまな生体分子に特異的な抗体を蛍光分子に化学的に結合させ、細胞内の特定の構造を染色するために使用できます。詳細およびその他の例については、「分子発現: 蛍光顕微鏡」を参照してください。
次のセクションでは、光学顕微鏡のコンポーネントとその機能について説明します。
は、蛍光顕微鏡用の光学セットアップであり、対物レンズは紫外光を標本に集束させ、標本からの蛍光を収集するために使用されます。別個のレンズまたはコンデンサーを使用して紫外光を標本に集束させる透過蛍光よりも効率的です。また、蛍光顕微鏡を同じ顕微鏡上の別のタイプと組み合わせることができます。
光学顕微鏡の部品
光学顕微鏡は、単純な学生用顕微鏡でも複雑な研究用顕微鏡でも、次の基本システムを備えています。
- 試料制御– 試料ステージを保持して操作します – 試料が置かれている場所クリップ– 試料をステージ上に静止させておくために使用します (拡大画像を見ているため、試料のごくわずかな動きでも画像の一部が画像の外に移動する可能性があります)マイクロマニピュレーター– X 軸と Y 軸に沿って制御された小さな増分で標本を移動できるデバイス (スライドのスキャンに便利)
- 照明– 標本に光を当てます (最も単純な照明システムは、部屋の光を標本を通して反射する鏡です。)ランプ– 光を生成します (通常、ランプはタングステン フィラメントの電球です。特殊な用途では、水銀ランプまたはキセノン ランプが使用される場合があります)顕微鏡によっては、試料をスキャンするためにレーザーを使用するものもあります。)レオスタット– ランプに印加される電流を変更して、ランプの強度を制御します。生成された光コンデンサー– ランプからの光を試料絞りまたはピンホール開口部に位置合わせして焦点を合わせるレンズ システム – コンデンサーに到達する光の量を変更するために光路に配置されます (画像のコントラストを高めるため)。部品と光路を示す典型的な学生用光学顕微鏡
- レンズ– 画像を形成する対物レンズ– 標本の接眼レンズから光を集める – 対物レンズから接眼レンズに画像を伝達し、拡大する – 多くの対物レンズチューブを保持する回転マウント – 接眼レンズを対物レンズから適切な距離に保持し、迷光を遮断する
- 焦点– 対物レンズを標本から適切な距離に配置します。粗焦点ノブ– 物体を対物レンズの焦点面に合わせるために使用します。微焦点ノブ– 画像の焦点を合わせるための微調整を行うために使用します。
- サポートおよびアライメントアーム– すべての光学部品を一定の距離に保持し、それらを位置合わせする湾曲した部分ベース– すべての顕微鏡部品の重量をサポートチューブは、ラックアンドピニオンギアを介して顕微鏡のアームに接続されています。このシステムにより、レンズや観察者を交換するときに画像の焦点を合わせたり、試料を交換するときにレンズをステージから遠ざけることができます。
上記の部品の一部は図には示されておらず、顕微鏡によって異なります。顕微鏡には、正立型と倒立型の 2 つの基本構成があります。図に示されている顕微鏡は、ステージの下に照明系、ステージの上にレンズ系を備えた正立顕微鏡です。倒立顕微鏡は、ステージの上に照明系、ステージの下にレンズ系を備えています。倒立顕微鏡は、細胞が成長するディッシュの底にレンズを近づけることができるため、培養細胞のディッシュなどの厚い標本を観察するのに適しています。
光学顕微鏡は、岩石や半導体などの非生物サンプルだけでなく、生きた細胞や組織の構造を明らかにすることができます。顕微鏡の設計は単純なものもあれば複雑なものもあり、複数のタイプの顕微鏡検査が可能なものもあり、それぞれがわずかに異なる情報を明らかにします。光学顕微鏡は生物医学の知識を大きく進歩させ、科学者にとって強力なツールであり続けます。
- 被写界深度– 許容可能な画像が得られる、焦点面の上から下までの垂直距離
- 視野 – 特定の対物レンズを使用して顕微鏡を通して見ることができる標本の領域
- 焦点距離– レンズが光を焦点に合わせるのに必要な距離 (通常はミクロン単位で測定)
- 焦点/焦点– レンズからの光が集まる点
- 倍率– 対物レンズと接眼レンズの倍率の積
- 開口数– レンズの集光能力の尺度
- 解像度– 最も近い 2 つの物体が別の物体として検出されなくなるまでの距離 (通常はナノメートル単位で測定)






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